バイヤーズガイド PCRテクノロジー
ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 技術は、生物医学、臨床診断、食品微生物学検査、犯罪法医学などのさまざまな分野で、数え切れないほどの研究および検査ラボの定番となっています。この基本的な技術は、サーマル サイクリングを使用して一連の反応を促進し、DNA サンプルを迅速かつ指数関数的に複製して、数百万または数十億の配列のコピーを生成します。新しい PCR システムを入手する際は、アプリケーションの最終目標、サーマル サイクリング装置の精度と効率、装置の容量と柔軟性を考慮することが重要です。この記事では、アプリケーションに適したシステムを絞り込むのに役立つ、PCR システムで利用可能なさまざまなオプションと機能の概要を説明します。
1. PCR 対 qPCR 対 dPCR
すべての PCR システムはポリメラーゼ連鎖反応を使用して DNA を複製しますが、特定の結果を得るためにシステムによって使用される方法論が異なります。これらの異なる方法の中には、標準 PCR、定量的 PCR (qPCR)、およびデジタル PCR (dPCR) があります。
標準的な PCR マシンは通常、さらに下流のテストと使用のために DNA を増幅するために使用されます。ある意味では、この技術は、分析試験方法自体としてではなく、最終製品を生成する手段として使用されます。増幅された DNA は、リアルタイムではなく、PCR 反応が完了している場合にのみ測定できるため、この方法はエンドポイント PCR と呼ばれることがあります。従来の PCR 増幅の最終生成物は、ダウンストリームのクローニングとシーケンシングに一般的に使用され、ゲル電気泳動を使用してチェックして、ターゲット シーケンスの存在とその相対量を低解像度 (バンド強度に基づく) で確認することもできます。
サンプル中に存在する標的配列の量をより迅速かつ正確に定量化するために、リアルタイム PCR としても知られる定量的 PCR (qPCR) では、増幅プロセス中に蛍光プローブを使用して、各熱サイクル後に存在する DNA の量を監視します。分析者は、蛍光強度の特定のしきい値を満たすために必要なサイクル数を観察することにより、結果を標準曲線と比較する際に出発物質の DNA 量を決定できます。qPCR は、エンドポイント PCR よりも迅速にターゲット シーケンスの有無を確認することもできるため、SARS-CoV-2 の検出などの診断アプリケーションで使用されます (最初に逆転写を使用してウイルス RNA を cDNA に変換します)。
デジタル PCR (dPCR) は、PCR 反応が何千もの個別の反応チャンバーで行われる別の定量的方法であり、元のサンプル内の DNA 分子の絶対数は、増幅が完了した後に蛍光シグナルを生成する反応チャンバーの数に基づいて決定できます。 . qPCR とは異なり、蛍光測定はリアルタイムで実行されず、サンプル中の DNA を定量化するために標準曲線は必要ありません。dPCR は通常、qPCR よりもスループットが制限され、コストが高くなりますが、DNA の定量化においてより正確、高感度、正確であり、まれな変異や一塩基多型 (SNP) の検出などのアプリケーションに特に役立ちます。
エンドポイント (定性的/半定量的) PCR と定量的 (qPCR または dPCR) メソッドのどちらを選択するかの決定は、アプリケーションを考慮すると比較的簡単ですが、qPCR と dPCR のどちらを選択するかは、より微妙な違いがある場合があります。qPCR は高スループットで費用対効果が高く、多くのアプリケーションで十分な感度を備えていますが、検出限界が低い絶対定量が重要な場合は dPCR の方が適している可能性があります。
2. 温度管理の重要性
サンプルの温度を正確かつ効率的に調整および制御するサーマルサイクラーの能力は、増幅反応の成功を可能にするものであり、あらゆる PCR システムを選択する際の中心的な焦点となるはずです。システムが異なれば、ランプ速度、温度の均一性と精度、および PCR 法の最適化を支援するためにサーマル ブロック全体で温度勾配を達成する機能に関して、さまざまな機能が提供される場合があります。
ランプ速度は、サーマル サイクリング ステップ間の温度変化の速度を指し、通常、機器の仕様では 1 秒あたりの摂氏度 (°C/秒) で表されます。メーカーは、最大ランプ レートと平均ランプ レートに関する情報を提供し、機器の上昇ランプ レート (加熱) と下降ランプ レート (冷却) を区別する場合があります。一般に、ランプ レートが高いほど実行時間は速くなりますが、購入者は装置の速度に関連する他の指標を調べずに最大ランプ レートに注目することに注意する必要があります。機器が最高のランプ レートを達成するのは短時間だけである場合があり、平均ランプ レートは温度変化のペースをより適切に反映します。ランプ レートの仕様は、特定の計測器が実行できる速度の一般的なアイデアを提供する場合がありますが、可能であれば、
温度の正確さと均一性も反応を成功させるための鍵であり、すべてのサーマルサイクラーは PCR に必要な温度を生成するように設計されていますが、特定の機能はより高い信頼性を提供できます。これは、サンプルが限られており、信頼できる結果が得られないアプリケーションにとって重要です臨床診断や法医学などで最も重要です。高分解能融解 (人事管理) 分析などの機密性の高い技術に PCR マシンを使用する場合、正確な温度制御も重要です。蓋を加熱すると、PCR チューブ全体の温度均一性が向上します。蓋を加熱しないと、サンプルが蒸発し、温度が低いチューブの上部に凝縮する可能性があります。サーマル ブロックの設計も温度制御に影響します。アルミニウムブロックは最も経済的なオプションですが、導電性が最も低くなります。つまり、導電性の高いブロックよりもゆっくりと温度均一性を達成し、ランプ レートが低くなります。銀および金でコーティングされたブロックはより高価ですが、熱伝達がより迅速に行われるため、ブロック全体の温度分布が均一になります。
最適な増幅結果を得るには、DNA ターゲットが異なれば、異なる温度が必要になる場合があります。たとえば、GC が豊富な配列では、変性のためにより高い温度が必要です。理想的なアニーリング温度は、さまざまな要因によっても影響を受けます。このステップの温度は、通常、プライマーの融解温度、プライマーペア間の融解温度の違い、および試薬濃度、pH、塩濃度の影響に基づいて選択されます。反応温度条件の最適化は複雑なタスクになります。温度勾配機能を備えた PCR マシンは、1 回の実行で複数のアニーリング温度をテストできるようにすることで、PCR 法の最適化を支援するように設計されています。PCR マシンを使用して分析する予定のサンプルの種類と多様性に応じて、
3.サーマルブロック
前述のように、PCR 装置で使用されるサーマル ブロックは温度制御に違いをもたらす可能性がありますが、ブロックの設計 (およびさまざまなブロックに対応するための装置の設計) も、スループット、消耗品のコスト、および柔軟性に影響を与えます。典型的なブロックは 96 ウェルまたは 384 ウェル形式ですが、48 ウェルや 1536 ウェルなどの他の形式も利用できます。ウェル数が多いほど、反応量が少なくてもスループットが高くなります。最初はコストがかかりますが、各ウェルに使用する試薬量が少なくなるため、最終的には反応あたりの価格が下がります。処理するサンプルの数とマシンを使用する頻度を考慮すると、ウェルカウントの少ないまたは多いサーマルブロックがラボにとって最も実用的で費用対効果が高いかどうかが決まります.
一部の機器には固定ブロックフォーマットが付属していますが、交換可能なブロックを使用できる機器もあり、96 ウェルフォーマットと 384 ウェルフォーマットの間、または異なるアプリケーション用の異なるブロック材料の間でより柔軟に切り替えることができます。一部のサーマルサイクラーは、同じ装置内に複数のブロックを収容することもでき、異なるプロトコルを異なるセットのサンプルで同時に実行できます.3 「ユニバーサル」寸法のブロックは、必要に応じて異なるサイズのチューブ、ストリップ、または PCR プレートを使用する柔軟性をさらに高めます。 .
このコンポーネントは温度制御、サンプル処理、およびスループットにおいて重要な役割を果たしているため、サーマルサイクラーを選択する際にはサーマル ブロックのオプションを慎重に検討する必要があります。サンプル量が少ないラボ、または日常的に少数のアッセイのみを実行しているラボでは、標準の 96 ウェル形式の低コストの固定ブロック装置で十分な場合があります。ただし、モジュール式の柔軟な機器は、プロトコルの数が多く、さまざまなサンプル量があり、独自のアッセイで同じ機器に依存するユーザーが多いラボや、将来的にスループット容量を拡張したいと考えているラボにとって有利な場合があります。